细胞培养中OD600测定注意事项

细胞培养中OD600测定注意事项

严格来说，细胞培养物在600 nm处的光密度（OD600）测量反映的是由浊度引起的散射光强度，而非吸光度。由于不同细胞类型的大小和形态存在差异（图1），光散射程度取决于生物量而非细胞数量，这些差异会影响散射光的强度。此外，细胞聚集现象也会干扰读数，因此生物量较低时（对应更低的OD600读数）测量结果更为可靠。因此，在对数生长期诱导细胞时，目标OD600值应约为稳定期OD600值的一半。达到该值所需时间因细胞类型、所用培养基和生长条件而异。因此，当更换细胞种类/菌株、培养基或生长条件时，需重新绘制生长曲线，通过监测OD600和每毫升菌落形成单位（CFU mL⁻¹）随时间的变化来确定*诱导时机。

图1 一些常见的细菌形态

为什么测定OD600的设备实验结果各不相同？

同一份样品在不同仪器上会测得不同的OD值。这是由于检测器接收到的散射光量存在差异，而该数值受仪器光学几何结构的影响，例如狭缝尺寸、检测器尺寸、以及这些光学元件与样品位置之间的距离（图2）。因此，使用某一台仪器（“仪器1”）绘制的生长曲线无法直接应用于另一台仪器（“仪器2”）的OD600测量。若需在仪器2上使用仪器1生成的生长曲线，需通过以下公式确定校正因子：

图2 不同光学几何结构的仪器对浊度样品测量的影响

随后，将此校正因子应用于“仪器2”进行的后续OD600测量中，所得数值将与原始生长曲线更为吻合。

样品容器的选择和使用

不同样品容器的材料和尺寸对光散射程度的影响存在差异。目前仍普遍使用圆柱形试管（如普通试管）进行OD600测量。与比色皿的平整界面相比，试管材料和瓶壁厚度不仅具有不同的透光特性，其折射特性也存在差异。因此，使用试管测量时，需对每个样品旋转试管数次并取平均值（图3）。

图3 该示意图展示了试管的俯视图，并演示了如何在重复测量间旋转试管以降低不规则折射的影响

正如不同细胞种类/菌株、培养基和生长条件需要单独绘制生长曲线，更换样品容器类型时也应创建新曲线。

创建标准曲线

• 在培养过程中按固定时间间隔取样，制备一组1 mL稀释液。取样间隔因目标细胞而异，可从分钟级到月级不等（如大肠杆菌培养通常每20-30分钟取样一次）。

• 对每个稀释液进行重复OD600测量，随后将其涂布于培养基平板上。经孵育后，选择菌落区分度*的平板进行计数。根据各平板的稀释因子换算后取平均值，即得1 mL样品中的菌落形成单位数（CFU）。

• 将每毫升CFU值与重复测量的平均OD600值随时间变化作图。

• 利用该生长曲线确定对数生长期对应的OD600值（即稳定期OD600值的一半），以实现细胞的*诱导